Extraktion von DNA - Molekularbiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik - page 20

CTAB Cetyl-Trimethyl-Ammonium-Bromid

NaCl Natriumchlorid

OD Optische Dichte

C t -Wert Schwellenwert-Zyklus

IPC Interne Positivkontrolle

LPE CTAB-Liquid Phase Extraction

SPE Solid Phase Extraction

IRMM Institute for Reference Materials and Measurements

3.1 Einleitung

Eine DNA-gestützte Analytik spielt im Lebensmittelbereich eine große Rolle. So
wird die PCR bzw. die real-time PCR z. B. für den Nachweis von Krankheitserreger
in Lebensmitteln, zur Tier- und Pflanzenartendifferenzierung und den Nachweis
von gentechnologisch veränderten Organismen eingesetzt [1] . Grundvoraussetzung
für die sehr sensitiven molekularbiologischen Methoden ist eine saubere und konta-
minationsfreie Nukleinsäure [2] . Die Qualität der Nukleinsäure entscheidet über Er-
folg und Misserfolg der anschließenden molekularbiologischen Analytik. Deshalb
werden im Bereich der Lebensmittelanalytik hohe Anforderungen an das jeweilige
DNA-Extraktionsprotokoll gestellt. Durch die Anwendung eines geeigneten Extrak-
tionsverfahrens soll die nachzuweisende DNA möglichst in hochmolekularer Form
und frei von die nachfolgende Analytik hemmenden Substanzen vorliegen [1] . Ge-
rade hier stellt die Natur der Lebensmittelmatrix eine besondere Herausforderung
dar. Matrixkomponenten wie Fette, Zucker, Proteine und sekundäre Inhaltsstoffe
erschweren die DNA-Extraktion und können, wenn sie nicht durch die Extraktion
vollständig entfernt werden, zu einer Inhibierung der PCR führen [3] . Des Weiteren
müssen auf der Matrixoberfläche vorhandene DNA-abbauende Enzyme gehemmt
werden [1] . Daneben spielt der Einfluss verschiedener chemischer und physikali-
scher Parameter (pH-Wert, Temperatur, Enzyme, Scherkräfte) bei der Lebensmittel-
produktion eine große Rolle für die Qualität der extrahierten DNA. So führen z. B.
hohe Temperaturen und saure pH-Werte während der Lebensmittelverarbeitung zu
einer Fragmentierung der DNA. Auch die physikalischen und chemischen Bedin-
gungen der verwendeten Extraktionsmethode beeinflussen die Qualität der DNA
[2] . Bleiben nach der Extraktion organische Lösungsmittel (Phenol, Ethanol), En-
zyme, Proteine oder Salze zurück, können diese ebenfalls eine nachfolgende PCR
inhibieren. Um eine Inhibition der PCR auszuschließen, sollten in der nachfolgen-
den Analytik entsprechende Inhibitionskontrollen mitgeführt werden [3] .
In einer PCR-Reaktion kann theoretisch ein spezifisches DNA-Molekül nach-
gewiesen werden. Deshalb ist es wichtig, dass die zu analysierende Nukleinsäure
nicht mit Fremd-DNA kontaminiert ist bzw. während der Extraktion kontaminiert
wird. Dies kann durch eine räumliche Trennung von Probenaufarbeitung, Ampli-
fikation und Detektion erfolgen [1] .