Molekulare Methoden zum Nachweis, zur Quantifizierung und zum Monitoring der Mykotoxinbildung lebensmittelrelevanter Pilze - Molekularbiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik - page 207

A zu bilden, sodass die beschriebenen PCR-Systeme weiterhin anwendbar sind.
Gil-Serna et al. ( 2009 ) beschrieben ein ITS-basiertes Real-Time-System zur gleich-
zeitigen Bestimmung von beiden Aspergillus- Spezies. Die genannten Aspergillus-
Spezies sind verantwortlich für das Vorkommen von Ochratoxin A in Produkten
wie Kaffe, Kakao, Gewürzen oder Wein (Fungaro et al., 2004 ; Abarca et al., 2003 ;
Thirumala-Devi et al., 2001 ). Zurzeit sind nur zwei Penicillium- Spezies beschrie-
ben, die Ochratoxin A bilden können: P. verrucosum und P. nordicum . Die erstge-
nannte Spezies kommt hauptsächlich in Getreide vor und ist in diesem Habitat in
der Lage, Ochratoxin A zu bilden. Die zweitgenannte Spezies kann auf fermentier-
ten Produkten wie luftgetrocknetem Schinken oder Salami gefunden werden (Lund
u. Frisvad, 2003 ). In den vergangenen Jahren sind einige Gene der Oxhratoxin-A-
Biosynthese identifiziert worden. Für die meisten Ochratoxin-A-bildenden lebens-
mittelrelevanten Spezies sind diagnostische PCR-Reaktionen entwickelt worden.
O'Callaghan et al. ( 2003 ) identifizierten eine Polyketidsynthase von A. ochraceus ,
die für die Ochratoxin-A-Bildung von Bedeutung ist. Anhand dieser Polyketid-
synthase und weiteren Ochratoxin-A-spezifischen Sequenzen wurden diagnosti-
sche PCR-Systeme entwickelt, die zum Nachweis von Ochratoxin-A-Bildnern wie
A. ochraceus , aber auch Citrininbildnern wie P. citrinum und M. ruber , geeignet
sind (Dao et al., 2005 ). Selma et al. ( 2009 ) benutzten ebenfalls die Ochratoxin-
Polyketidsynthase, um ein Real-Time-PCR-System zum Nachweis von A. niger
und A. carbonarius in Trauben zu entwickeln. Sie konnten damit eine Sensitivi-
tät von 10 4 Genomäquivalenten in Gegenwart von Trauben-DNA erreichen. Ein
ähnliches System wurde von Atoui et al. ( 2007 ) beschrieben. Perrone et al. ( 2004 )
beschrieben z. B. ein PCR-System, das zur Differenzierung von A. carbonarius
von anderen „schwarzen Aspergillen“ wie A. japonicus geeignet ist. Dieses PCR-
System ist gegen das Calmodulingen dieser Spezies gerichtet, das offensichtlich ge-
nügend Variabilitäten aufweist. Schmidt et al. ( 2004b ) wandten die SCAR-Metho-
de an, um anonyme Marker für die Ochratoxin-A-Bildung zu identifizieren. Mittels
AFLP-Analyse wurde eine Bande identifiziert, die nur in potenziell ochratoxinbil-
denden A. carbonarius -Stämmen vorkam. Primer, die von dieser Sequenz abge-
leitet wurden, waren spezifisch und konnten zum Nachweis von A. carbonarius in
Kaffee benutzt werden. Zur Überprüfung der Sensitivität wurde kontaminierter mit
nichtkontaminiertem Kaffe gemischt. Selbst bei einem Verhältnis von 1:99 zeigt
die PCR-Reaktion noch ein positives Signal. Erst bei einem Verhältnis von 0,1:99,9
ergab die PCR ein negatives Ergebnis. Mit einem ähnlichen Ansatz entwickelten
diese Autoren spezifische Primer für A. ochraceus (Schmidt et al., 2003 ), die sie
ebenfalls zum Nachweis und zur Quantifizierung dieser Spezies mittels real-time
PCR in grünem Kaffe einsetzten (Schmidt et al., 2004a ). In dieser Arbeit konnte ein
Zusammenhang zwischen den Real-Time-PCR-Ergebnissen und dem Vorkommen
von Ochratoxin A gezeigt werden. Ein weiteres Nachweissystem für A. ochraceus
wurde von Fungaro et al. ( 2004 ) beschrieben. Auch dieses System wurde einge-
setzt, um A. ochraceus in Kaffee nachzuweisen.
Der genetische Hintergrund der ochratoxinbildenden Penicillien ist schon weiter-
gehend aufgeklärt. Kürzlich wurden verschiedene Gene des Biosyntheseweges cha-
rakterisiert (Karolewiez u. Geisen, 2005 ; Geisen et al., 2006 ). Anhand der Sequenz