Praktischer Teil - Protein-Microarrays fur die Wirkstoffentwicklung - page 45

binden kann (Daten nicht gezeigt). Somit wurde HtpG auch mit Cy3-ATP und
ATP auf dem Microarray inkubiert. Dieser Versuch war erfolgreich und das
Cy3-ATP wurde mit ansteigender Konzentration von ATP immer stärker aus
der ATP-Bindungstasche des HtpG verdrängt. In Abbildung 20a ist ein Aus-
schnitt des gescannten 16-Pad-Chips nach erfolgreicher Immobilisierung des
mit Cy3-ATP fluoreszenzmarkierten Hsp90α und HtpG-Proteins abgebildet.
In den ersten zwei Fünferreihen von links in jedem Pad ist das Hsp90α und
nächsten zwei Fünferreihen das HtpG gespottet. Das Pad links oben ist die
Positivkontrolle bestehend aus FPI-Puffer und 100 nM Cy3-ATP. Dort ist die
Fluoreszenz am stärksten. Die anderen Pads wurden jeweils mit einer anderen
Konzentration (50 μM, 5 μM, 0,5 μM, 50 nM, 5 nM, 0,5 nM, 50 pM) von ATP
im FPI-Puffer mit 100 nM Cy3-ATP inkubiert. Die höchste Konzentration be-
findet sich rechts oben und die Inhibitorkoenzentration nimmt von links nach
rechts und von oben nach unten ab. Es lässt sich schon direkt nach dem Scan
eine Fluoreszenzabnahme bei den höheren Konzentrationen feststellen. Bei
den geringeren Konzentrationen an ATP ist die Fluoreszenzabnahme mit dem
bloßen Auge auf dem Scan marginal.
Zur genaueren Auswertung wurde der Chip mit dem Program ImaGene
5, Excel und Origin ausgewertet. Die Grafik ist in Abbildung 20b abgebildet.
Die Kurve zeigt wie zuvor bei Hsp90α die normalisierte Fluoreszenzabnahme
von Cy3-ATP gegen die logarithmisch aufgetragene Konzentration von un-
markiertem ATP. Der IC 50 -Wert beträgt 1,095 ± 0,6 μM und ist im Vergleich
zum IC 50 -Wert des humanen Hsp90α höher. Es wurde dennoch eine Verdrän-
gung durch direkte Kompetiton auf dem Chip nachgewiesen und somit konnte
der Assay für die nachfolgenden Versuche weiter verwendet werden.