Praktischer Teil - Protein-Microarrays fur die Wirkstoffentwicklung - page 43

Der nächste Schritt war die Inkubation von Cy3-ATP und unmarkiertem
ATP, sodass sie um die Bindestelle konkurrieren können. Es wurde als „Inhi-
bitor“ als erstes unmarkiertes ATP verwendet, damit belegt werden konnte,
dass die Weiterentwicklung des Assays anwendbar ist und die Verdrängung
weiterhin durch die abnehmende Signalintensität detektierbar ist. In späteren
Versuchen wurde das unmarkierte ATP durch Inhibitoren, die Geldanamycin-
strukturanaloga sind, ersetzt. Das Cy3-ATP lag in einer Endkonzentration von
100 nM vor und das unmarkierte ATP wurde als Verdünnungsreihe in acht
Verdünnungen von 50 μM - 50 pM in FPI-Puffer angesetzt. Jedes Pad wurde
mit 50 μL Cy3-ATP/ATP-Lösung inkubiert. Zuvor wurde der Chip mit einer
Hybridisierungskammer versehen, die die 16 Felder voneinander trennt. Als
Positivkontrolle diente ausschließlich FPI-Puffer (symbolisiert vollständige
Verdrängung des Cy3-ATP) und als Negativkontrolle 100 nM Cy3-ATP in
FPI-Puffer ohne Inhibitor.
Durch die Negativkontrolle konnte gezeigt werden, dass Cy3-ATP an das
Hitzeschockprotein bindet und nicht vollständig hydrolysiert. Für jede Pro-
teincharge wurden zehn Spots beim Spotten aufgetragen, was eine Zehnfach-
bestimmung pro Konzentration des zu untersuchenden Inhibitors gewährleis-
tet. Die Inkubation erfolgte über Nacht bei 4 °C schüttelnd bei 300 rpm unter
Lichtausschluss in einer Feuchtkammer.
Am nächsten Tag wurde jedes Pad mit 100 μL FPI-Puffer zweimal für
fünf Minuten gewaschen. Ungebundes ATP bzw. Cy3-ATP wurde dadurch
entfernt. Die Hybridisierungskammer wurde entfernt und der Chip mittels
Druckluft getrocknet. Die Auswertung erfolgte durch Messung der Fluores-
zenzsignalintensitäten und es wurde der normalisierte Anteil von verdrängten
Cy3-ATP gegen die logarithmische Inhibitorkonzentration hier ATP in einer
Kurve aufgetragen. Die Bewertung der Verdrängung erfolgte dabei über den
IC 50 -Wert. Dieser gibt die Konzentration der Inhibitorsubstanz an, bei der eine
halbmaximale Verdrängung des Cy3-ATP erreicht wird.