Praktischer Teil - Protein-Microarrays fur die Wirkstoffentwicklung - page 42

darauf bei 4 °C statt. Probleme bei der Reproduzierbarkeit der Daten führten
zur Weiterentwicklung des Assays.
Anstelle des bisher verwendeten FITC-GA sollte Cy3-ATP eingesetzt
werden. Vorteile dieser Methode sind zum einem, dass es sich bei ATP um
den natürlichen Liganden der Hitzeschockproteine handelt und damit eine hö-
here Affinität an der ATP Bindestelle garantiert ist. Zum anderen ist Cy3-ATP
wesentlich stabiler als FITC-GA, wodurch die Fehleranfälligkeit des Assays
verringert wird. Durch die Anwendung von ATP kann der Assay schneller
auch auf andere Hitzeschockproteine, die Geldanamycin eventuell nicht bin-
den können, übertragen werden. Hinzu kommt, dass die verwendeten Geräte
für Cyaninfarbstoffe ausgelegt sind und somit die Detektion der Intensität für
Cy3 im optimalen Bereich erfolgt. Die Effekte des Photobleaching können
verringert werden. FITC hat seine Emissionmaximum bei 514 nm und Cy3 bei
570 nm. Unsicher bleibt zunächst, welchen Einfluss die natürliche Hydrolyse
des ATP durch Hsp90α auf die Intensität des Signals hat.
Es wurde ein neuer direkt-kompetitiver Assay entwickelt, sodass das
Cy3-ATP anstelle von FITC-GA mit den Inhibitoren um die ATP-Binde-ta-
sche konkurrieren muss (s. Abb. 18b). Der Assay wurde um einen Tag ver-
kürzt, weil Cy3-ATP gleichzeitig mit den Inhibitoren zu dem Protein dazu ge-
ben wurde und sie gleichzeitig um die ATP-Bindetasche des Hitzeschock-
proteins konkurrieren. Desweiteren wurde dadurch die Gefahr der möglichen
ATP-Hydrolyse um einen Tag verringert. Das Hsp90α lag in einer Konzentra-
tion von 3 mg· mL -1 im Einfriermedium (Storage-Puffer) vor. Die Proteinlö-
sungen wurden mit einem Nano-Plotter kontaktfrei auf die Nitrozellulose-
membran eines NEXTERION ® NC-N16 slide gespottet. Für die Spotting-pa-
rameter wurden acht Tropfen per Spot eingestellt, sodass ein Spot aus circa
800 - 1600 pL Proteinprobe besteht. Auf jedes Pad wurden zehn Spots der
Proteinlösung gedruckt. Anschließend wurden die Mikrochips 30 min bei
Raumtemperatur getrocknet und 45 min in Storage-Puffer mit 1 % BSA schüt-
telnd inkubiert. Dies diente zur Blockierung freier unspezifischer Bindestellen
auf der Nitrozellulosemembran, sodass es zu keiner unspezifischen Bindung
von Cy3-ATP kommen kann. Danach folgte ein 20-minutiger Waschschritt
mit Storage-Puffer, der dreimal wiederholt wurde. Es dient dazu nicht gebun-
denes Protein und überschüssiges BSA zu entfernen.