Praktischer Teil - Protein-Microarrays fur die Wirkstoffentwicklung - page 36

mehrere publizierte HtpG Sequenzen, bekannt sind die der Stämme 195, 210
und 230. Es könnte sein, dass es sich bei dem hergestellten HtpG um einen
neuen Stamm handelt.
Außerdem wurde die Hydropathie der beiden HtpGs aus H. pylori mit der
des humanen Hsp90α verglichen. Das experimentell hergestellte HtpG unt-
scheidet sich in seiner Hydropathie zu dem publizierten HtpG nur ein zwei
Stellen. Die erste Stelle liegt bei den Aminosäurepositionen 110-122. Dort
verhält sich die Hydropathie des experimentell hergestellten HtpG eher wie
die Hydrophatie des humanen Hsp90α. An der zweiten Stelle bei den Amino-
säurenpositionen 225-235, ist die Hydrophatie des experimentell hergestellten
HtpG größer als die der anderen beiden Proteine. Bis hier hin kann noch nichts
über die Bedeutung der veränderten Aminosäuren gesagt werden. Es wurde
mit diesem Konstrukt mit dem vorhanden Unterschieden weitergearbeitet.
3.1.4 Expression und Aufreinigung von HtpG
Für die Kultivierung wurde zuerst eine Vorkultur der positiven Kolonie „Nr.
9“ angezogen und die Hauptkultivierung dieser fand in einem 1,5 L Bioreaktor
mit Batch-Betriebsweise statt. Die Induktion erfolgte mit 1 mM ITPG bei
16 °C über Nacht. Es wurde eine niedrigere Temperatur für die Induktion ge-
wählt, sodass die Proteinproduktion in den Zellen verlangsamt und nur das
Zielprotein synthetisiert wurde und keine endogenen HtpG induziert werden.
Dadurch ließ sich eine höhere Menge an gewünschtem Protein erzielen.
Die Biotrockenmasse der E. coli -Kultur betrug 12 g und wurde in Lyse-
puffer resuspendiert. Außerdem wurde Proteaseinhibitor dazugeben, um die
Proteine vor Degradation zu schützen. Der Zellaufschluss erfolgte in einer
French-Press, weil bakterielle Zellen auf Grund ihrer stabilen Zellwand Drü-
cke bis zu 100 bar aushalten können. Die French-Press ist ein diskontinuierli-
cher Hochdruck-Homogenisator, bei dem die Zellsuspension unter hohem
Druck bis zu 1000 atm von einem Kolben durch eine Düse gepresst wird.
Durch die plötzliche Entspannung entstehen sehr hohe Scherkräfte und Kavi-
tationseffekte. Durch anschließendes Zentrifugieren werden Zelltrümmer, wie
Zellmembran und Zellkern, von dem löslichen Protein getrennt. Anschließend
wurde der Überstand in Lysepuffer aufgenommen und auf Eis gelagert. Da