Praktischer Teil - Protein-Microarrays fur die Wirkstoffentwicklung - page 34

Abbildung 14: Ergebniss der Touchdown-PCR von den gepickten E.coli -Klonen nach der
Übernacht-Kultivierung. M: GeneRuler TM 1 kb DNA Ladder (Fermentas, St. Leon-Rot), 1-
10: Zehn PCR-Produkte von verschiedenen Plasmiden.
doppelsträngige DNA. Als Restriktionsenzym diente Nhe I. Es hat zwei
Schnittstellen im Vektor, eine im Insert und eine außerhalb des Vektors. In der
Abbildung 12 sind die Schnittstellen von Nhe I eingezeichnet. Über die Größe
der entstehenden Fragmente kann entschieden werden, ob das Insert die rich-
tige Orientierung im Vektor besitzt. Die entstehenden Fragmente nach dem
Restriktionsenzymverdau sollten 1749 bp und 5760 bp groß sein. Ist das Insert
falsch herum in den Vektor hinein kloniert worden, sollten die Fragmente
717 bp und 6792 bp groß sein. Die Konzentration des Plasmids wurde am
Photometer gemessen und betrug 48,85 ng·μL -1 . Der Restriktionsenzymver-
dau zeigte im Agarosegel, dass das Insert richtig herum in dem pET SUMO
Vektor kloniert wurde (Daten werden auf Grund der schlechten Fotoqualität
nicht gezeigt).
Anschließend wurde erneut 20 mL der Kultur mit der positiven Kolonie
aufgereinigt und in 100 μL dest. Wasser aufgenommen. Die Konzentration der
Plasmidlösung betrug 96,55 ng·μL -1 und das gereinigte Plasmid konnte zum
Sequenzieren zu Eurofins MWG Operon, Ebersberg, DE geschickt werden.
Die Sequenzierungsprimer wurden von der Firma hergestellt.