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(300 rpm) bei Raumtemperatur, der dreimal wiederholt wird. Er dient dazu
nicht gebundenes Protein und überschüssiges BSA zu entfernen.
Die Inkubation des Cy3-ATP und der Inhibitoren erfolgt gleichzeitig. Da-
für wird ein 50 μL Mix per Pad bestehen aus jeweils 100 nM Cy3-ATP, FPI-
Puffer und den jeweiligen potentiellen Inhibitoren in unterschiedlichen Kon-
zentrationen (50 μM, 5 μM, 0,5 μM, 50 nM, 5 nM, 0,5 nM, 50 pM) angesetzt
und auf die durch eine Hybridisierungskammer getrennten Pads gegeben. Des-
weiteren wird eine Negativkontrolle (FPI-Puffer + 100 nM Cy3 ATP) und eine
Positivkontrolle (FPI-Puffer) aufgetragen. Die Hybridisierungskammern wer-
den mit einer selbstklebenden Folie abgedeckt und die Inkubation erfolgt in
einer dunklen Feuchtkammer bei 4 °C schütteln (300 rpm) über Nacht.
Am nächsten Tag wird jedes Pad dreimal mit 100 μL FPI-Puffer bei 4 °C
für 5 min gewaschen und mit Druckluft getrocknet. Anschließend werden die
Chips mit dem Axon Scanner GenePix 4000 B mit den folgenden Scannpara-
metern gescannt; Emission: 532 nm, laser power: 33 %, PMTgain: 350 und
dem Programm GenePix Pro 6.1. Die entstehenden Bilder werden durch die
Programme ImaGene 5, Excel und mit Origin detailliert ausgewertet. Die Be-
wertung der Verdrängung erfolgt dabei über den IC
50
-Wert.
