Materialien und Methoden - Protein-Microarrays fur die Wirkstoffentwicklung - page 75

5.11 Zusammensetzungen der Nährmedien
Alle Medien werden, wenn nicht anders beschrieben bei 121 °C und 1 bar für
20 min autoklaviert. Nach dem Autoklavieren und Abkühlen wurde dem Me-
dium 50 μg·ml -1 Kanamycin zugesetzt.
LB-Medium (10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 10 g NaCl, ad 1 L H 2 O (pH 7,4))
LB-Agar (10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 10 g NaCl, 15 g Agar, ad 1 L H 2 O
(pH 7,4))
5.12 Ligation
Für die Ligation wird der Vektor und das Insert in einem molaren Verhältnis
von 1:2,5 verwendet und der Ligationsansatz besteht aus 0,5 μL PCR-Produkt,
1 μL 10x Ligationspuffer, 2 μL pET SUMO Vektor, 5,5 μL sterilem Wasser
und 1 μL T4 DNA Ligase. Die T4 Ligase verknüpft unter ATP-Verbrauch
freie 3'-OH-Enden mit 5'-Phosphatresten unter Ausbildung von Phosphodies-
terbindungen. Die Ligation erfolgt über Nacht bei 16 °C im Thermozykler.
5.13 Transformation
Nach der Ligation werden 3 μL des Ligationsansatzes für die Hitzeschock-
transformation in BL21(DE3) One Shot ® Chemically Competent E. coli Zellen
verwendet. Die Transformation wird nach dem Protokoll des Champion TM
pET SUMO Protein Expression System durchgeführt. 100 μL des Transfor-
mationansatzes werden auf einer LB-Agarplatte mit 50 μg·mL -1 Kanamycin
ausgestrichen und bei 37 °C im Brutschrank über Nacht inkubiert. Am nächs-
ten Tag werden 10 positive Kolonien gepickt und in jeweils 20 mL LB-Me-
dium mit 50 μg·mL -1 Kanamycin bei 37 °C, 160 rpm für 8 h angezogen (Trans-
formationskultur).