Praktischer Teil - Protein-Microarrays fur die Wirkstoffentwicklung - page 31

Für die finale Elongation wurde eine halbe Stunde gewählt, da die DNA des
Proteins mit 1866 bp ein großes Oligonukleotid ist und sicher gegangen wer-
den sollte, dass die verbleibende einzelsträngige DNA am Ende auch vervoll-
ständigt wurde. Zu erwähnen ist, dass zusätzlich zu dem Standard-PCR-Mix
noch 0,5 μL Pfu -DNA-Polymerase dazugegeben wurde, sodass die Wahr-
scheinlichkeit passender PCR-Produkte erhöht wurde.
Zur Auftrennung der DNA sowie zur Kontrolle der erfolgreichen PCR
wurde eine Agarosegelelektrophorese durchgeführt. Das generierte PCR-Fra-
gment des Proteins HtpG ist 1866 bp groß und wurde auf der richtigen Höhe
zum Marker fokussiert (Daten nicht gezeigt). Das Fragment wurde aus dem
Agarosegel herausgeschnitten und mit dem QIAquick Gel Extraction Kit nach
den Angaben des Herstellers wiedergewonnen. Dieser Reinigungsschritt ent-
fert die Primer, Nukleotide, Enzyme, Salze, Agarose und Ethidiumbromid, so-
dass die DNA danach in bidestillierten Wasser vorliegt. Die Konzentration der
DNA wurde mittels eines NanoDrop Spectrophotometers gemessen und be-
trug 112,26 ng·μL -1 .
Die anschließende Klonierung und Expression wurde mit dem Champi-
on TM pET SUMO Protein Expression System durchgeführt. Abbildung 12
zeigt schematisch das Klonierungskonstrukt nach erfolgreicher Ligation. Das
Plasmid ist 7509 bp groß. Der pET SUMO Vektor benutzt ein Ubiquitin-ähn-
liches modifiziertes Protein (SUMO). SUMO ist das Smt3 Protein aus Sac-
charomyces cerevisiae und ist 11 kDa groß. Es erhöht die Expression, verbes-
sert die Löslichkeit des rekombinaten Proteins und erleichtert die Aufrein-
igung bzw. Generierung eines nativen Proteins in E. coli . Das N-terminale
Histidinhexamer des Vektors dient der Detektion und Aufreinigung des Fusi-
onsproteins mittels Affinitätschomatographie mit Metallionenchelaten wie
Ni 2+ -NTA als Ligand. Es gewährleistet eine schnelle und effiziente Aufreini-
gung. Danach lässt sich das SUMO-Fusionsprotein leicht entfernen, da der
Vektor eine SUMO Proteaseschnittstelle besitzt. Die SUMO Protease (Ulp)
schneidet spezifisch das SUMO Protein ab. Außerdem besitzt der Vektor einen
lac Promotor, der vor der Multiple Cloning Site liegt, sodass die Expression
des gewünschten Gens durch ITPG induziert werden kann und eine starke Ex-
pression in E. coli stattfindet. Darüber hinaus besitzt der Vektor ein Kanam-
ycin Resistenzgen für die Selektion in E. coli .